微小残留病(MRD)检测

白血病、恶性淋巴瘤及多发性骨髓瘤是常见的血液肿瘤,微小残留病(Minimal Residual Disease, MRD)是指上述血液肿瘤经过治疗缓解后,在体内残留少量白血病细胞的状态,是白血病复发的重要原因。准确的MRD检测可以早期预测白血病复发、对病人的危险程度进行分层、指导缓解后治疗以及确定骨髓或干细胞移植的最佳时间。

MRD检测的重要意义

白血病、恶性淋巴瘤及多发性骨髓瘤是常见的血液肿瘤,微小残留病(Minimal Residual Disease, MRD)是指上述血液肿瘤经过治疗缓解后,在体内残留少量白血病细胞的状态,是白血病复发的重要原因。准确的MRD检测可以早期预测白血病复发、对病人的危险程度进行分层、指导缓解后治疗以及确定骨髓或干细胞移植的最佳时间。

MRD检测方法

治疗缓解后残留的血液肿瘤细胞数量一般较少,需要用非常灵敏的方法来进行检测。2018年儿童急性淋巴细胞白血病诊疗方案推荐了如下四种MRD评估方法:

1. 流式细胞法

利用白血病细胞和正常细胞间抗原表达异常区分白血病细胞和正常细胞,是目前应用最广泛、最快速的方法。但是只有那些和正常细胞(包括正常幼稚细胞)间存在明显不重叠差别的抗原或抗原组合才能用于MRD监测;并且常规的流式细胞法检测的敏感性只有10-4;同时白细胞表面抗原的免疫漂移现象会干扰MRD的检测。

2. 融合基因定量RT-PCR

监测灵敏度高,但只有不到50%病例存在融合基因,导致其适用性非常有限。

3. IgH/TCR重排定量PCR

监测灵敏度高,线性好,90-95%以上病例可用此方案。但该方法需设计患者特异性探针,操作繁琐,耗时长,同时会由于白血病克隆进化带来的探针结合区域的基因发生突变而造成漏检。

4. 新一代测序(NGS

基于BCR/TCR重排进行MRD监测,95%以上病例可以应用这一方法,可克服RT-PCR的一些局限性,并且在分析足够数量的细胞时可增强敏感性(10-5-10-6)。NGS提供了治疗期间和治疗后的与预后相关的B细胞和T细胞的信息,可用于分析免疫系统多样性、免疫重建等,质量比较稳定,但是使用的校准仪、质量控制和正确解释NGS数据指南仍然缺乏。

泛因医学NEO-MRDTM检测产品

泛因医学MRD检测产品是基于的准确无偏的多重扩增技术进行MRD检测,操作简便、敏感性可以到到10-5-10-6,同时不受肿瘤细胞表面抗原漂移及克隆进化的影响。该检测产品首先对治疗前肿瘤样品的TCR/BCR基因进行测序分析,确定肿瘤克隆,然后在治疗后的样品中检测肿瘤克隆的负荷水平,准确灵敏的评估MRD水平,同时可以监测是否有新的高频克隆出现,评估由于原肿瘤亚克隆或演化克隆导致的复发风险。

1. NEO-MRDTM检测原理

NEO-MRDTM首先对治疗前肿瘤样品的TCR/BCR基因进行多重PCR扩增和测序分析,确定肿瘤克隆,然后在治疗后的样品中检测肿瘤克隆的负荷水平,准确灵敏的评估MRD水平。

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2.    NEO-MRDTM技术特征及优势

(1)  准确灵敏的实验系统。该系统是基于准确无偏的Ig/TCR多重PCR实验系统进行肿瘤克隆鉴定和MRD检测的。在多重PCR中不同引物扩增效率的差异会带来扩增偏差,通过实验技术及数据处理算法的持续研发,我们将引物扩增效率优化至十分均衡,而均衡的扩增系统将带来MRD定量的高准确度和高灵敏度。

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(2)扩增多条受体链提高肿瘤细胞的检出率。实验体系包括IGH、IGK、IGL、TRB、TRG的受体链,可以准确的鉴定肿瘤细胞的标志序列,同时每条链还包括不同位置(FR1、FR2、FR3)的引物,可以有效的避免由于肿瘤细胞的突变引起的假阴性或定量不准确。

(3)原创的生物信息分析工具。由于部分样品的MRD水平极低,需严格控制测序错误及序列污染。我们通过原创的数据处理技术可以有效的校正测序错误及去除实验过程可能出现的微量污染,保证检测的准确性。

3.    NEO-MRDTM的优势

(1)操作简便,流程标准化和自动化,减少人为操作误差。可以实现从DNA到检测报告的全自动化。重复性好。

(2)建立在无偏扩增系统上,准确性高,敏感性可以到10-5-10-6,同时不受肿瘤细胞表面抗原漂移及克隆进化的影响。

(3)在58个真实临床样品检测中,NGS和流式都阳性的25个样品两种方法的一致性较好,14个样品流式阴性,NGS阳性,19个样品二者都阴性。

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(4)可以监测是否有新的高频克隆出现,评估由于原肿瘤的亚克隆或演化克隆导致的复发风险。

(5)可以对免疫系统的重建情况进行评估。

4.NEO-MRD适应症:

急性淋巴白血病(ALL)

骨髓、外周血

慢性淋巴白血病(CLL)

骨髓、外周血

多发性骨髓瘤(MM)

骨髓

淋巴瘤

骨髓、外周血、淋巴结

5. 送样要求:

  骨髓和外周血都需要用EDTA抗凝管,样品需备注是治疗前的还是治疗后的。


样品类型

样品量

配送条件

治疗前

骨髓(新鲜)

>0.5 ml

4 oC (采样48小时内送到)

骨髓(冰冻)

>0.5 ml

干冰

外周血(新鲜)

> 2 ml

4 oC (采样48小时内送到)

外周血(冰冻)

> 2 ml

干冰

DNA

> 0.5 µg

干冰

治疗后

骨髓(新鲜)

>1 ml

4 oC (采样48小时内送到)

骨髓(冰冻)

>1 ml

干冰

外周血(新鲜)

> 2 ml

4 oC (采样48小时内送到)

外周血(冰冻)

> 2 ml

干冰

DNA

> 1 µg

干冰

6. MRD检测灵敏度与送检样品量的关系

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7. 检测流程注释:灵敏度是指肿瘤细胞在总的有核细胞中的比例

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(1) 标本采集:采用EDTA采血管,骨髓穿刺时注意被血液稀释导致的检测不准确或假阴性。

(2) DNA提取:兼容市场上大部分DNA提取方法,提取的DNA -20oC保存。

(3) 文库构建,基于我们准确无偏的Ig/TCR多重PCR实验系统,加入内参评价并校正实验过程中的偏差。为了提高适用性和检测准确性,B-ALL检测时扩增完全重排的IGH(引物组合包括:FR1-J和RF3-J)、不完成重排的IGH(D-J引物组合)、IGK重排(FR1-J、FR3-J、FR1-kde、FR3-kde、intro-kde)、IGL重排(FR1-J和FR3-J);T-ALL检测时扩增TRB和TRG受体链。

(4) NGS测序,需要根据文库构建时的DNA量,计算细胞个数,根据细胞个数确定测序数据量。

(5) 数据分析:通过原创的数据处理技术有效的校正测序错误及去除实验过程可能出现的微量污染,保证检测的准确性。

(6) 自动化报告生成:将通过质控的数据导入分析软件,可以直接生成检测报告。

(7) 报告确定:人工对分析数据和报告的关键指标进行检查,确保检测报告的正确性。

8. 检测周期

  从收到样品之日起15个自然日。



参考文献

1.  Wu, J., et al., Minimal Residual Disease Detection and Evolved IGH Clones Analysis in Acute B Lymphoblastic Leukemia Using IGH Deep Sequencing. Front Immunol, 2016. 7: p. 403.

2.  Faham, M., et al., Deep-sequencing approach for minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 2012. 120(26): p. 5173-80.

3.  Wu, D., et al., High-throughput sequencing detects minimal residual disease in acute T lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med, 2012. 4(134): p. 134ra63.

4.  Wu, D., et al., Detection of minimal residual disease in B lymphoblastic leukemia by high-throughput sequencing of IGH. Clin Cancer Res, 2014. 20(17): p. 4540-8.

5.  van Dongen, J.J., et al., Minimal residual disease diagnostics in acute lymphoblastic leukemia: need for sensitive, fast, and standardized technologies. Blood, 2015. 125(26): p. 3996-4009.



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